Identificación automática de nosemosis en imágenes microscópicas

En las últimas décadas el diagnóstico de enfermedades en el laboratorio ha usado sistemas informáticos desarrollados con técnicas de visión artificial, lo cual también puede aplicarse para la nosemosis.

La nosemosis es una enfermedad ocasionada por los microsporidiosNosemaapis y Nosemaceranae, que afecta las funciones digestivas de las abejas productoras de miel. Las consecuencias de la enfermedad son tales que pueden afectar a colmenas enteras matando a todos sus individuos, un fenómeno conocido como Síndrome de despoblamiento de colmenas. Asimismo, es una enfermedad que ha generado preocupación a nivel mundial sobre todo por la resistencia ambiental de las esporas formadas por estos microsporidios así como la facilidad para su difusión.
Las esporas de Nosemaspp presentan una forma oval cuya medida varía entre 5- 7µm x 3-4µm aproximadamente, con un contorno oscuro. Con el fin de confirmar el diagnóstico de la enfermedad, una muestra que contenga el tracto intestinal de las abejas melíferas es analizada mediante trituración y observación a 400 aumentos utilizando un microscopio óptico. La cantidad de esporas por abeja indica la gravedad de la infección: superado determinado índice, se indica realizar un tratamiento medicamentoso para evitar la mortalidad de la colmena, motivo por el cual el diagnóstico no solo consiste en determinar la presencia sino en cuantificar la concentración de esporas de nosemas por abeja, con el menor factor de error posible, señala un trabajo de investigación desarrollado por Patricio Castro, Mauro Cambarieri, entre otros y que nuestro medio presenta en versión periodística. 
El método actualmente empleado y consensuado internacionalmente para laboratorios de diagnóstico se basa en identificar y contar el número de esporas de manera visual, colocando el macerado de abeja en una cámara de recuento celular (cámara de Neubauer) y observando mediante microscopía común. 
Normalmente se selecciona el 5% de las colmenas de un apiario para muestreo, extrapolando el resultado obtenido al resto de las colmenas del mismo. Este aspecto no es menor debido a que la nosemosis no se distribuye de manera homogénea en un apiario, por lo cual muchas veces los resultados obtenidos del análisis de algunas colmenas no son representativos de lo que ocurre en las restantes. En el caso en que fueran seleccionadas por azar colmenas con alto grado de infección, estaría indicada la medicación del total de las colmenas del apiario, aún cuando estas no tuviesen altos índices de infección de nosemosis, incurriendo en un elevado costo para el apicultor y generando problemas potenciales de salud pública y comercialización por presencia de residuos de antimicrobianos en miel. En sentido contrario, en el caso en que por azar el 5% de colmenas muestreadas no presentara un alto índice de infección de nosemosis, estaría contraindicada la medicación del apiario, en cuyo caso es altamente probable que algunas colmenas infectadas y no incluidas en el muestreo mueran por nosemosis en el curso del año.
En las últimas décadas el diagnóstico de enfermedades en el laboratorio ha usado sistemas informáticos desarrollados con técnicas de visión artificial, lo cual también puede aplicarse para la nosemosis. A medida que la tecnología avanza se hace posible encontrar una manera más eficaz de identificar y contar las esporas de forma automática.
Imágenes de muestras de abejas procesadas para el diagnóstico de nosemosis y tomadas desde el microscopio óptico, pueden proporcionar información cualitativa y cuantitativa importante que permita la sustitución de la visión humana por un método automático como el propuesto, brindando la posibilidad de obtener un criterio unificado y objetivo en el diagnóstico de nosemosis.
Contar con un método alternativo que permita estudiar la totalidad de las colmenas del apiario, brindaría una herramienta diagnóstica para el eficiente control de esta enfermedad. Esta tarea se podría realizar a través de la visión por computador, área de
la inteligencia artificial, ya que permite a las computadoras entender el mundo visual al igual que los seres humanos. El objetivo de este trabajo se centra en la identificación de la forma y tamaño de las esporas de nosemas en las microfotografíasdigitales, para desarrollar un sistema automatizado que permita su identificación y cuantificación, usando la biblioteca OpenCV con el lenguaje de programación Java.

Propuesta de solución

Uno de los principales problemas al desarrollar un sistema de visión por computador es poder elegir las técnicas de procesamiento adecuadas para conseguir extraer la información necesaria y lograr el objetivo planteado. En consecuencia, se probaron distintas técnicas basadas en diferentes sistemas automatizados desarrollados precisamente en esta misma área. De ahí que se realizaron diferentes etapas para poder elaborar el trabajo, entre las cuales se encuentran la adquisición de la imagen, el pre-procesamiento, la segmentación, la búsqueda de contornos, la detección de elipses y, por último, el conteo de estas elipses que en este contexto representan las esporas de nosemas.

Adquisición de la imagen 

Se tomó una muestra de abejas pertenecientes a un apiario de la localidad de Carmen de Patagones, que se conservaron con alcohol etílico hasta su procesamiento conforme método estandarizado (OIE, 2013), Con el fin de conocer aquellos parámetros dependientes de métodos de microscopía óptica que permitan obtener imágenes con menor ruido de fondo, se evaluaron imágenes directas e imágenes obtenidas luego de incluir diferentes modificaciones a las técnicas microscópicas básicas, como el agregado de colorantes y uso de microscopía de contraste de fase. 
Se seleccionaron 12 imágenes de un total de 24, obtenidas en la primera sesión de captura, para incluirlas en la primera etapa de pruebas y validación del método desarrollado, en base a su diversidad en calidad y cantidad de nosemas según el método estándar o manual.

Preprocesamiento

Como se mencionó anteriormente, se aplicaron diversas técnicas de preprocesamiento de imágenes microscópicas, tales como la conversión a escala de grises, filtro de desenfoque gaussiano, umbral adaptable y transformaciones morfológicas. El objetivo principal de aplicar estas técnicas es mejorar la calidad de la imagen. En principio se convirtió la imagen de la muestra a escala de grises, con el fin de eliminar los niveles de tono y saturación, manteniendo la luminancia. Después de eso, se aplicó el filtro de desenfoque gaussiano para hacer la imagen más suave usando un núcleo de convolución obtenido mediante experimentación. Así, al estar más suavizadas se detectan menos los bordes del fondo y se destacan los bordes de las esporas. La técnica de umbral adaptable se utiliza para transformar las imágenes resultantes en imágenes binarias y eliminar la mayor parte del fondo de la misma. Las operaciones morfológicas, como la dilatación y la erosión se aplican a la imagen binaria para aumentar el relieve de los bordes y eliminar en mayor medida aquellos objetos que no se desean detectar para lograr una resultante más satisfactoria.

Conteo de esporas

Por lo general, las esporas de nosemas tienen una forma elíptica más alargada que circular y con un determinado tamaño que varía en un rango de 5-7μm x 3-4μm aproximadamente. Considerando estas medidas, se asumió que toda figura preseleccionada de forma elíptica con medidas de ancho y longitud de la elipse dentro del rango mencionado, correspondería a una espora de Nosemaspp. En caso contrario, la parametrización descartó del conteo las elipses al no pertenecer al criterio de selección.

Conclusiones

En este trabajo se presentó un método para la identificación y conteo de esporas de nosemas de forma automática en imágenes microscópicas basado en su forma y tamaño. En 11 de los 12 casos estudiados (aproximadamente el 92 %), los resultados obtenidos al comparar ambos métodos fueron similares (ver figura número 11). Mientras que en solamente un caso estudiado (aproximadamente el 8 %) se observó una diferencia significativa entre los resultados obtenidos por ambos métodos (ver caso número 8 en la figura número 11). En este caso, el método automático identificó 59 esporas, de las cuales 38 fueron falsos positivos al comparar con el método manual que identificó solo 21 esporas. Se asumió que el método automático identificó falsos positivos debido a que el método manual fue considerado como método de referencia.
El método automático se mostró significativamente más veloz que el método manual: para la observación de 12 muestras, consumió 50 veces menos tiempo (ver tabla número 1). Asumiendo que en 1,2 minutos el método pudo procesar 12 muestras, en una jornada de 8hs de trabajo el método sería capaz de procesar al menos 4.800 muestras, mientras que el método manual solo podría procesar 90. Considerando apiarios promedio de 100 colmenas, en un día de trabajo el método automático sería capaz de procesar las muestras de todas las colmenas de 48 apiarios, mientras que el método manual no alcanzaría a procesar la totalidad de las colmenas de un solo apiario. Si este análisis se traduce en costo económico del análisis de nosemosis, se puede pensar en que el método automatizado podría disminuirlo en 50 veces la fracción del costo debida a gastos por recursos humanos vinculados al análisis (horas de trabajo). Estos dos aspectos (mayor rapidez y menor costo) hacen del método automatizado una herramienta aplicable para estudios epidemiológicos a escala provincial o nacional. 

Por otra parte, debemos tener en cuenta que este trabajo se realizó en un solo laboratorio, y  debiera considerarse que el método manual es susceptible de subjetividad del laboratorista, razón por lo cual es esperable que se presenten variaciones en los resultados para la misma muestra, cuando ésta es procesada en diferentes laboratorios. Al respecto, se prevee realizar una validación de método incluyendo la participación de diversos laboratorios con muestras de las mismas colmenas, para confirmar la fortaleza del método automático con respecto a la repetibilidad de resultados y unificación de criterio de discriminación de esporas. Como trabajos futuros, además, se tiene previsto la optimización del método automático mejorando cada una de las etapas, en especial la segmentación y los filtros en la detección de contornos y conteo de elipses. Se deberá incorporar además una capa de persistencia de datos para llevar un registro de las imágenes analizadas, poder identificar a que colmena pertenece cada imagen y a partir de ello calcular estadísticamente el nivel de incidencia de nosemosis por colmena, la necesidad de tratamiento antimicrobiano, y la eficiencia de dicho tratamiento realizando análisis posteriores. El método manual (actualmente utilizado) no cuenta con un registro inequívoco de resultados al que se pueda recurrir en aquellos casos de conflicto entre el propietario del apiario y los laboratorios de diagnóstico, cuando los resultados de análisis no correspondan con el criterio del propietario del apiario en casos de compra, venta, así como movimiento de colmenas en el marco de la trashumancia, cada vez más frecuente ante el cambio del ecosistema agrícola en respuesta a la fuerte sojización y pérdida de zonas con floración aptas para apicultura. El resguardo de las imágenes en una base de datos ofrece una solución a este problema, sumando trazabilidad al diagnóstico de esta enfermedad, de aplicación para los controles sanitarios de organismos oficiales. Por otro lado, se buscará generalizar el método para la detección de otras enfermedades similares, en abejas u otras especies, basados en las características de forma y tamaño del agente etiológico